Ⅴ.茶皂素的溶血与鱼毒作用

朱全芬  夏春华  樊兴土  柳荣祥  田洁华  王路  唐丽萍

（中国农业科学院茶叶研究所，杭州310008）

摘     要

对鱼、虾、鸡及人体的离体血液和鱼、虾活体及血液的显微观察比较研究结果表明，茶皂素对血液中的红细胞都有溶血作用，而对蓝细胞和虾血细胞则无作用。对红细胞的毒性作用主要表现在破坏细胞膜而使细胞质外渗，导致红细胞解体。对鱼类的毒性，主要是通过破坏鱼鳃的上皮细胞而进入鳃血管和心脏，使血液中的红细胞产生溶血。茶皂素的溶血率曲线“S”型，即溶血不是匀速的，而是在某一段时间里特别快。达到每毫升标准血球悬浮完全溶解约需纯茶皂素30μg。茶皂素的溶血速度随其稀释倍数的缩小而加快。茶皂素的溶血指数为100000。

关键词：茶皂素，鱼毒活性，溶血性，对虾，鱼

前    言

前三报的研究结果表明，鱼、虾虽同为鳃呼吸，但茶皂素对鱼类具有明显的鱼毒作用，而对虾的毒性很小，且在一定浓度范围内尚有促进生长的作用。茶皂素的毒性机理是什么？已知茶皂素对冷血动物具有致死的毒性，对血液具有溶血作用。为进一步揭示茶皂素的鱼毒活性的作用过程、茶皂素的鱼毒活性与溶血性之间的关系，特对茶皂素的溶血效应和茶皂素作用下的鱼、虾等不同生物的血液及活体组织的变化进行了细胞学的观察比较研究。

材料与方法

1. 供试药剂：茶皂素Ⅰ（见前报）。

2. 鱼：体长8—60mm鳖条。

3. 对虾：体长90—100mm的刀额新对虾。

4. 供试血液：离体鲤鱼血、人血、鸡血及对虾心脏血液。血样的采集：用医用针筒，分别从鲤鱼的主动脉和鸡翅膀的静脉抽样鱼血和鸡血；用医用微量吸血管从指尖采集人血；用针刺取得活对虾心脏的血液。

5. 显微观察和摄影仪器：上海光学仪器厂生产的ZXCⅣ生物显微镜和江西光学仪器总厂生产的XZ—1显微照相仪。

（二） 方法

1. 茶皂素的溶血性观察    将离体的各种血液制成血膜。操作方法：取一干净无油脂的载玻片，滴上一滴刚获得的新鲜血液，推成血膜，置空气中自然凝固干燥。血膜制成后，在膜一半处，加滴一小滴茶皂素溶液，采用推血膜的办法，将溶液均匀涂于血膜半面，干燥后再以瑞氏（Wright）或吉姆氏(Gimas)染色剂染色,经阿拉伯树胶封片,而后进行显微照相记录。

2.不同条件下鱼体组织比较  采用1L的玻璃烧杯，加入1000ml溶液培养。试验设10、50和100mg/L三种不同茶皂素浓度。将在茶皂素溶液中培养至严重中毒和致死的鱼体组织及鳃血、心脏血细胞，与未经茶皂素处理自然死亡的鱼体组织和血细胞比较。鱼鳃在未染色固定前先进行观察记录其自然状态，然后再将样本进行染色固定。

对在10mg/L茶皂素溶液中培养至近死亡的鱼和未加茶皂素培养的鱼，用显微镜透光观察各部位差异，并进行显微照相记录。

3.不同培养条件下对虾组织的比较

采用50L容量的聚氧乙烯桶培养，总溶液30升。试验设15‰盐水和20mg/L的15‰盐度溶液两种处理。培养过程中两种处理的虾均成活正常，经3h后未出现异常,取其鳃进行显微观察。另制片进行鳃、鳃血细胞和心脏血细胞染色固定，显微照相记录。

4.茶皂素的溶血效应试验

（1）茶皂素的溶血率曲线和时间—稀释率曲线测定  由于溶血试验所需血量大，本试验采用鸡血的红细胞为材料进行研究，以确保试验的可比性。用柠檬酸钠作抗凝剂，1%氯化钠等渗液3次洗涤血液，配置成标准血球悬浮液，即1ml血液所得之血球悬浮于20ml的1%氯化钠溶液中。

利用红细胞溶血前后透明度的变化，根据体系的透光度（T），间接反映茶皂素对红细胞的溶血作用过程。

应用721分光光度计，选择使血色透光最强的波长λ，然后选择合适的血液浓度、比色皿大小和比色计的灵敏度，使溶血试验的透光性变化明显反映在仪器读数上，以读数不再变化的透光度Tmax为完全溶血（100%），以无皂素处理的同浓度的血试验的透光度T0为完全未溶血（0%），在时间t时测得的透光度Tt所对

Tt-T0应的溶血程度        ×100设为θ，以θ对应t作图得溶血率曲线，并以茶皂Tmax-T0素浓度（或血溶西施倍数），对100%溶血（即Tmax时的t值）时间作图即得时间—稀释率曲线。

（2）茶皂素溶血当量的测定，即每毫升标准血球悬浮液所消耗的固体茶皂素量的测定（mg/ml）利用红细胞在未溶血前，静止沉淀后上清液为无色，溶血后带红色的电解质在上清液中，其颜色深浅与皂素溶血程度成正比的原理，从溶血后上清液吸光率的变化作茶皂素溶血的标准曲线，并通过偏离标准曲线的点，推算茶皂素对标准血球悬浮液的溶血当量。

结果及分析

1. 茶皂素的溶血性

通过鲤鱼、鸡和人体3种血膜茶皂素处理比较（图版Ⅰ：1—3）可以看出，

茶皂素对红细胞都有溶血作用。无论是有核的鲤鱼血或鸡血的红细胞，还是无核的人血红细胞，在接触茶皂素的一端均产生溶血；处于正在溶血状态和未溶血的红细胞的交界面，可以清楚的看到茶皂素破坏红细胞膜的状况：首先是破坏膜，随之细胞质外渗（见图版Ⅰ：4），最终整个红细胞的膜全部被破坏，有核的红细胞（如鸡、鲤鱼的红细胞），仅剩下细胞核，无核的红细胞（人血）则呈一片胶质状态。而对血液中的白细胞却没有这种作用，如从图版Ⅰ：5、6溶血后的鲤鱼和鸡的血膜涂片中，可以看到它们仍安然无恙。

有关虾类血液的资料极少，在对其血细胞的形态缺乏感性认识情况下，进行茶皂素对虾类离体血液作用的研究，首先是从判别虾血细胞入手的。在取出注射活虾心脏后（此时的心脏仍处于博动状态），分别对其外围组织液、心脏肌肉及心脏针刺流出液进行涂片、染色和固定，在确定确定血液及血细胞的基础上进行茶皂素处理。

用茶皂素对虾心脏血液涂片作涂布试验发现，茶筇素对虾血细胞并不产生破坏作用，与鲤鱼血膜相比，虾血涂片则容易被茶皂素溶液所稀释，亦即虾血溶液的凝固性不及鲤鱼血。

2．茶皂素对鱼类的毒性作用

上述试验结果表明，茶皂素的溶血作用必须是在血液接触药剂的情况下才能产生，那么茶皂素又是进入鱼体的呢？

通过不同条件下鱼体组织的显微观察，结果表明，茶皂素的鱼毒作用首先是破坏鱼鳃组织，然后由鳃进入微血管。未经茶皂素处理的活鱼鳃和自然死亡的鱼的鳃是鲜红的，而接触茶皂素后的鱼鳃微血管则变成黑色。从显微观察上可以看到，由单层细胞组成的鱼鳃上皮细胞遭到了破坏，微血管外露。并且，茶皂素的这种作用随着其浓度的提高而增强，当浓度提高至100mg/L时，中毒死亡的鱼鳃仅留下微血管道，上皮细胞已完全遭破坏，这时鱼的中毒死亡速度也加快，如鱉条鱼，茶皂素的浓度在10mg/L时需2—3h才中毒死亡，当浓度提高到100mg/L时则只需20—30min就中毒死亡。

对8—10mm的鱼苗进行显微观察显示，正常活鱼的鱼体是透明的，并可见到心脏部位的血液的鲜红的，而经茶皂素培养中毒后的鱼体，其心脏部位已逐渐变黑，且不透明，说明已产生溶血。其次，从尾部显微照相记录发现，茶皂素的毒性对尾部最外延表皮细胞也产生破坏作用，引起尾端血管向外开放和血液外流。

鱼鳃上皮细胞的破坏，导致茶皂素与血液接触，从而引起红细胞的溶解。从图版Ⅱ：1、2比较中可见，在茶皂素的作用下，鳃血中的红细胞已剩不多，基本上多是细胞核。中毒后的鱼的心脏血液观察结果亦然，出现了不少被溶血后的红细胞核，且细胞核的数量随中毒程度的加深而增加。

以上结果表明，茶皂素是通过破坏鱼鳃的上皮组织，与鱼的血液接触产生溶血中毒，并且随着呼吸作用和血液循环，导致心脏血液溶血而使鱼中毒死亡。

3.茶皂素对对虾影响

利用与鱼相同的研究方法，对对虾进行了试验，只是所用水质为15‰的盐水。从培养中存活状况来看，茶皂素浓度为20mg/L条件下经3h，对虾无异常现象。经解剖，虾鳃的显微观察显示，处理与对照间没有差别。

对鳃鱼和心脏血液进行涂片观察比较，结果也无异常变化。

从上述三个方面的研究结果，基本上可以看出茶皂素的鱼毒作用：从溶血性方面看，主要是破坏红细胞膜，引起细胞质外渗，而对红细胞以外的血细胞未发现这种作用；对鱼类而言，首先是对鳃的上皮细胞产生严重的破坏作用（这与Vogel G的试验结果一致），从而使鳃微血管外露，茶皂素有了与血液接触的机会，引起溶血。所以，茶皂素的毒性包括鱼毒和溶血两个方面。显而易见，茶皂素对同样以鳃为呼吸器官的甲壳类的对虾却无此作用，其原因也可能有两个方面：一方面，与血液的结构有关，鱼的血液中携氧载体为血红素，核心为Fe++,而对虾血液携氧载体为血兰素，其核为Cu++ ,另一方面，与虾鳃的结构有关，因为虾鳃是从角质层发育而来的一个角质层区，表皮的主要成份是几丁质和蛋白质，而几丁质（C32H54N4O21）n 是复杂的含氮多糖类，与鱼鳃的结构及成分截然不同。

4．茶皂素的溶血效应

溶血效应通常用两种方法观察：一是溶血曲线，二是时间—稀释率曲线。

采用721分光光度计，波长510nm,灵敏度4，比色皿3㎝。血液浓度50%（以标准血球悬浮液计），对七种不同浓度的溶血率及其时间—稀释率进行了测定。结果表明，各处理的溶血趋势一致，250、100、50、30和25mg/L等5个浓度的溶血率曲线，均呈“S”形，说明其溶液血不是匀速的，而是在某一时间内特别快；稀释倍数越小，溶液血速度越快。例如稀释至40000倍（250 mg/L）全溶时间需37min,  稀释倍数为4000（250 mg/L）时仅需5min。

茶皂素的溶血当量测定，是指从定量的角度推断茶皂素的溶血性能。试验分别从茶皂量和血液体积均为变量、血量为定值和茶皂素为变量、茶皂素为定量和血量为变量3个方面进行测定。试验条件：波长480nm,灵敏度2，比色皿1㎝，蒸馏水作空白。

从3份图表分析，无论怎样改变试验条件，茶皂素的溶血性能均非常稳定，即：（1）当溶液中茶皂素I含量在10—20mg/L范围时，溶血速度加剧，即“S”形的突变阶段，以10 mg /L时为折点，故溶血指数为10000，这一结果与上述时间—稀释率曲线测定结果相同。从溶液溶血后的沉淀观察发现，当浓度小于10 mg /L时，沉淀带红色，文明有 残剩的未溶血的红细胞（完全溶血时沉淀为白色）。

(2)达到每每毫升标准血球悬殊浮液完全溶解，约需茶皂素I30μɡ。

（3）当血溶液中的茶皂素含量已达到完全溶血时，每毫升血液所产生的离子浓度的E值是相同的，各处理溶血后的E值处在同一直线上，如果茶皂素含量未能达到全溶时，E值就偏离直线，在图3上将偏离直线的3号、2号、1号的3个处理点作水平线，与标准曲线相交，通过交点作垂线，在x轴上可以找出3号的溶血量为12.7ml，2号的溶血量为12.3ml，1号的溶血量为1.65ml。根据上述实验数值，可推算出试验1—10号每毫克茶皂素的溶血量分别为8.26、30.77、21.19、14.93、10.0、6.67、4.28、2.50、1.10ml。其中在2号处出现极大值30.77ml，精确地说，这个极大值在1—2号之间，即10—20mg/L间，说明茶皂素在某一浓度时发挥的作用最大。

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